本研究会の会員による論文解説を掲載します。 【タイトル】CRISPR-Casシステムを用いたノックインマウス作製における凍結受精卵培養時間の検討 【本研究の概略】従来の過剰排卵誘起法に比べ、雌マウス1匹からより多くの採卵が可能な超過剰排卵誘起法を用いて体外受精を行い、前核期受精卵を凍結保存した。実験計画に合わせて必要数の凍結受精卵を融解し、2-7時間の培養後、異なるタイミングでマイクロインジェクションを行い、CRISPR-Casシステムと1本鎖オリゴヌクレオチドあるいはPITCh (Precise Integration into Target Chromosome) システムを利用した3種類のノックインマウス作製を試みた。マイクロインジェクションを行うまでの受精卵の培養時間を変えることにより、ノックインマウスの作製効率に差異が生じた。そのため、本研究はノックインマウスを作製する際の有用な知見を提供できると考える。 【著者】中川佳子1、佐久間哲史2、西道教尚3、横崎恭之3、竹尾透1、中潟直己1、山本卓2 1熊本大学生命資源研究・支援センター 動物資源開発研究施設(CARD)資源開発分野 2広島大学大学院理学研究科 数理分子生命理学専攻 分子遺伝学研究室 3広島大学保健管理センター インテグリン治療開発フロンティア研究室 【内容】近年、急速に開発が進んでいるゲノム編集技術をマウス受精卵へ応用することにより、遺伝子改変マウスの作製期間は大幅に短縮されつつある。私達は、超過剰排卵誘起法、体外受精、受精卵の凍結保存などの生殖工学技術とゲノム編集技術を活用した遺伝子改変マウスの作製を目的とし、これまでに体外受精由来の凍結受精卵を用いてTALENやCRISPR-Casシステムによる効率的なゲノム編集個体の作製が可能であることを報告した(Nakagawa et al., 2014, 2015, 2016)。しかしながら、ノックインマウスの作製効率は、ノックアウトマウスの作製効率ほど高率ではなく、ノックインマウスの作製効率を改善することは主要な課題であった。そこで、本研究では、凍結受精卵の融解後の培養時間が、CRISPR-Casシステムと1本鎖オリゴヌクレオチドおよびPITChシステムを用いたノックインマウス作製効率に及ぼす影響について調べた。体外受精後、凍結保存した受精卵を融解、2-7時間培養後、異なるタイミングでマイクロインジェクションを行い、ノックインマウスの作製効率が異なるか否かを検討した。1本鎖オリゴヌクレオチドを用いたノックインマウス作製では、全ての実験区においてノックインマウスを作製することが可能であったが、短時間と長時間培養において、得られた産子のうちノックインマウスの割合が高くなる傾向が見られた。一方、PITChシステムを用いたノックインマウス作製では、短時間培養においてのみ目的とするノックインマウスを作製することができた。今回の報告では、融解後の培養時間が産子への発生率に影響を与えることも示唆されたため、本研究が、目的や個体作製方法の違いによってマイクロインジェクションを行うタイミングを考慮し、より効率的な遺伝子改変マウス作製を行うための一助となれば幸いである。 【出典】Culture time of vitrified/warmed zygotes before microinjection affects the production efficiency of CRISPR-Cas9-mediated knock-in mice. Nakagawa Y, Sakuma T, Nishimichi N, Yokosaki Y, Takeo T, Nakagata N, Yamamoto T. Biol Open. 2017; 6(5):706-713. doi: 10.1242/bio.025122. URL: http://bio.biologists.org/content/6/5/706.long
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