Q40:マウス腹腔内注射で過排卵処理をする際にPMSG(eCG)およびhCGの投与量が国際単位(IU)で記載されていました。天然ビタミンEは0.67mg=1IUとあったのですが、購入したアンプルのホルモンでは何mgで1IUなのかがわかりません。投与量5IUに調製する方法を教えてください。
ホルモンの場合、国際単位(IU)は説明書やアンプル等に記載されています。例えば、あすか製薬のゴナトロピンには、以下のように記載された製品があります。 ・ゴナトロピン筋注用1000単位 ・ゴナトロピン注用5000単位 これはアンプル1本に上記単位のホルモンが入っていることを意味します。すなわち、国際単位で1000単位、あるいは5000単位を含むということになります。マウスの場合、1000単位のアンプルであれば、20mlの生理食塩水に溶かすと、0.1mlあたり5IUとなります。一般に、マウスでは、両者のホルモンを1匹あたり5IU〜7.5IU投与しますので、0.1ml〜0.15mlを腹腔内注射しています。 アンプル1本を基準に考えれば良いので、重さを計測する必要はありません。
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一般的なマニュアル(例:マウス胚の操作マニュアル)にはeCGとhCGの投与間隔は42〜48時間と幅があります。また、これを実際に検討したデータがあり(日本実験動物技術者協会関東支部REG部会第20回特別講演会(2019年)、外丸祐介ら)、C57BL/6系統の場合、eCGとhCGの投与間隔は32〜56時間であれば排卵数に大きな違いはないという報告が成されています。さらに、IASe(Hyper Ova)とhCGの投与間隔が48〜54時間においては、排卵数に差がないことが知られています(第50回日本実験動物技術者協会総会 (2016) 中牟田裕子ら)。系統や週齢によっても異なってきますが、上記の報告から推察するとPMSG(eCG)とhCGの投与間隔は、48時間±6時間程度であれば、問題ないと思われます。
なお、ご承知のように、eCGは卵胞発育、hCGは排卵誘発作用があります。排卵はhCGを投与して12〜14時後ぐらいから始まりますが、マウス卵子の受精能保有時間は排卵後6〜8時間程度と考えられていることから(受精能保有時間を過ぎた老化卵子を体外受精に用いると、受精率や発生率に大きな影響を及ぼすため)、hGC投与後18時間以内に採卵・媒精することをお勧めします。 結論から言いますと、PMSG(eCG)もHyper Ovaも4週齢(幼若)あるいは10週齢(成熟)がお勧めで、最適週齢に違いはありません。しかし、Hyper Ova の場合は、eCGが効きにくいと言われる5〜7週齢でもeCGと比較して、排卵数が有意に多くなるデータが示されています。
C57BL/6は晩熟型の系統で、性腺系が確立するまでの移行期(5~8週齢)、特に性成熟に達する直前直後の7~8週齢で、内因性のホルモンバランスが不安定であると考えられています。従って、7~8週齢がeCGへの反応性が最も弱く、発育卵胞数が少なくなると推察されています。また、マウスでは4週齢以降、すでに卵胞発育を阻害するインヒビンを分泌している可能性があり、これが直接的あるいは間接的に発育卵胞数をさらに減らしているものと考えられています。 Hyper Ovaは抗インヒビン血清とeCGから作られており、これを使用すると、分泌されているであろうインヒビンを抗インヒビン血清が中和するため、5~8週齢でもeCG単独よりも排卵数が多くなると考えられています(参照論文のTable 1のeCGとIASeのデータ参照)(eCG:14〜29個、IASe:26〜54個)。 繰り返しになりますが、Hyper Ovaも幼若の場合は4週齢、成熟の場合は10週齢に投与が理想ですが、4週齢、10週齢のメスマウスが手に入らない場合でも、すべての週齢でcCGに比べて排卵数が有意に多くなるHyper Ovaの使用は効果的だと考えられます。 詳細は以下の論文を参照ください。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X19301669?via%3Dihub 発生工学は、「主に哺乳動物を対象として、生殖細胞、初期胚あるいは多分化能を有する細胞に対し、何らかの遺伝子操作を加えて発生の過程を操作する方法や、その操作によって得られた動物の解析や利用を研究する領域」と理解することができます。つまり、発生工学は、分子生物学(遺伝子工学)、生理学(病態生理学)、組織学(病理学)、実験動物学、繁殖学(生殖工学)などから構成される統合的な研究領域であり、in vivoの遺伝子機能解析系であると考えられます。
また、生殖工学は人工繁殖技術や生殖補助医療技術を包含するとともに、生殖細胞・胚操作技術を中心とした発生工学の一部を構成する研究・技術領域であると考えられます。胚操作技術の単独利用で本来in vivoで起きる現象をin vitroで再現させることや、自然界では存在し得ない個体の人為的作成を発生工学に含める考え方もあるようですが、これらは生殖工学に分類されるのが適切かと思われます。 大きな違いは、冷却した際に、氷の結晶が細胞内外に形成されるか否かです。凍結保存方法は氷の結晶を成長させながら冷却します。一方、ガラス化保存は氷の結晶を生じさせずに冷却します。
哺乳動物の卵子や胚の細胞質は、85%程度が水で構成されています。これらの細胞を氷点下まで冷却すると氷晶を形成しますが、細胞内の氷晶形成は細胞を物理的に破壊することになるので、細胞の凍結保存においては、これを防ぐことが最大の課題と言えます。このため、保存液に凍結保護物質を添加しています。細胞を長期間保存するためには、(多くの水分を含む)細胞を固体にしなければなりませんが、液体が固化する場合には氷晶を形成する場合と形成しない場合があり、後者をガラス化(vitrification)と呼んでいます。これは、低温下で液体の粘度が高まり、一定の温度(ガラス化転移温度)以下で固化する現象で、氷晶を形成しないのが特徴です。ちなみに、細胞内のガラス化転移温度は−130℃ですので、ガラス化した細胞の保存には、ドライアイス(−79℃)ではなく液体窒素(−196℃)が必要です。 グリセロール、エチレングリコール、DMSO、プロピレングリコール等は分子量が100以下ですが、これらは細胞膜を浸透することのできる凍結保護物質として用いられています。また、凍結前の平衡での細胞内の急激な脱水、融解後の細胞内への急激な水の流入防止といった細胞膜の保護のために、細胞膜を透過せず浸透圧効果のあるシュクロースやラフィノースなどの少糖類や高分子物質を生理的な溶液に添加しています。
液体窒素中で生きた細胞を凍結保存すると、すべての代謝活性がほぼ停止し、半永久的に保存可能と言われています。唯一問題となるのは、保存期間中に受ける宇宙や地中などに由来する自然放射線の影響ですが、バックグラウンドの放射線量(自然放射線)の84倍量の放射線を29ヶ月間照射(約200年間の自然放射線線量相当)した凍結胚において、融解後の生存性や得られた産子には、まったく影響がなかったとの報告があります(Whittingham et al., Long-term storage of mouse embryos at -196 degrees C: the effect of background radiation. Genet Res 29:171-181, 1977)。
また、25年間液体窒素中に凍結保存したマウス胚から正常な産子が生まれていますし、家畜においても、20年間保存されたウシの凍結精子の人工授精で産子が得られています。 従って、胚や精子を液体窒素中で凍結しておけば、半永久的な保存が可能と思われます。 発生率は低いですが、正常な産子へと発生します。移植胚の10〜20%が産子へ発生し、その後の発育や繁殖能力も正常であることを経験しています。
また、人為的にマウスの2細胞期胚あるいは4細胞期胚の割球を2分離(それぞれ1/2胚、2/4胚)して体外培養後、桑実胚および胚盤胞に発生した2分離胚を移植した結果、1/2胚では25%、2/4胚では29%が産子へ発生したことが報告されています(富樫ら、マウスの2細胞期胚分離による一卵性双生仔の作出、家畜繁殖誌、33: 51-57、1987)。 Q6:ドライシッパーに液体窒素を十分に充填して海外へ送ったのですが、結果的に液体窒素がカラになってサンプルは融けていました。このドライシッパーは故障(不良品)していたのでしょうか?
輸送中にドライシッパーが転倒していたと思われます。ドライシッパーを横倒しの状態で置くと、5〜6日で液体窒素が蒸発し、凍結精子や胚が融解してしまいます。必ず、上面にTHIS SIDE UPと注意書きをして、輸送中に横倒しにしないようにしてもらうことが重要です。 宅配業者毎に液体窒素の取り扱い規定が異なります。通常の液体窒素タンクは扱いませんが、タンクが倒れても液体窒素がこぼれないドライシッパーは取り扱う業者もあります。さらに同じ業者でも地域によって扱いが異なりますので、事前の確認が必要です。
通常の組織は適用外ですが、卵巣、精巣、精巣上体、精管などの生殖器・副生殖器は、卵子や精子を含んでいるため、生殖細胞と同じと見なされ、カルタヘナ議定書のルールが適用されます。
胚移植する初期胚の発生ステージによって異なります。レシピエントマウスにプラグがついた当日(0.5 dpc)は、前核期受精卵〜8細胞期胚を卵管に移植します。また、8細胞期胚から胚盤胞を移植する場合には2.5 dpc(あるいは3.5 dpc)に子宮に移植します。要するに卵管ステージの初期胚は卵管に、子宮ステージの胚は子宮に移植するのが一般的です。また、子宮ステージの胚を0.5 dpcの卵管に移植することも可能です。この場合、レシピエントの妊娠日令に合わせて分娩されます。しかし、卵管ステージの胚を子宮に移植することは現実的ではありません。また、レシピエントの妊娠日齢が初期胚の発生日齢より進んでいると、胚移植しても妊娠しないので注意してください。
さらに、プラグ確認日であっても深夜の移植になると移植胚が着床することはありませんので注意が必要です。これは卵管上皮細胞の繊毛運動が変化することによって胚の移動が妨げられることが原因と推察されます。日中忙しくて移植ができなかった場合は、深夜まで働くことは避け、改めて移植実験を設定するようにしてください。 Q10:マウスの凍結保存胚を融解した結果、数個の2細胞期胚と数個の桑実胚が残りました。少数の胚を移植した場合には分娩が遅延して結果的に産子を得ることができないので帝王切開が必要になると聞きました。里親を用意していません。どうしたら良いでしょうか?
大丈夫です。2細胞期胚と桑実胚を一緒に卵管に移植してください。両者ともにレシピエントの妊娠日令に合わせて発生します。発生時期の異なる胚が移植された場合には、着床後に胚の発生が同調することが報告されています(Ueda et al., Possible expansion of “window of implantation” in pseudopregnant mice: Time of implantation of embryos at different stages of development transferred into the same recipient. Biol Reprod 69; 1085-1090, 2003)。また、毛色の異なる他の系統の胚が用意できるのであれば、それらと一緒に移植するのも一つの方法です。 体外受精は、卵子も精子も体外に取り出して培地内で受精させます。一方、人工授精は体外に取り出した精子を子宮や卵管に注入して受精させます。人工授精では「授精」を用い、「受精」とは記載しないことに注意してください。
2018年3月8日追記 受精(fertilization) は運動する配偶子である精子が運動しない配偶子である卵子に侵入する生物現象であり、体外受精(in vitro fertilization)は、体外の培養液内で受精現象を再現させることを示す用語であるのに対し、人工授精(artificial insemination)は雄から採取された精液を雌の生殖器内に注入するという人間の行為を表わす用語です。 ちなみに、英語の受精(fertilize) の語源はラテン語の ferre (生む、出産する、結実する)に由来するのに対し、授精(inseminate)の語源は ラテン語のinseminare (まき散らす、移植する)であり、inseminare の語源を更に遡ると in (入れる) + semen (ラテン語で種子) です。 従って、日本語での発音がたまたま同じだけで、受精(fertilization) と 授精(insemination)は全く異なった概念です。 ご質問は、受精能獲得のための培養(前培養)をどれだけ延長できるのか?ということと理解します。前培養10時間の成績は持っておりませんが、24時間後には受精することはほとんどないことが報告されています。37℃、5%CO2、95%空気の気相下で24時間培養した150精子/μlの濃度の精子の受精率は0%、750精子/μlの濃度の精子の受精率は、わずか1%でした。しかし、37℃、5%CO2、95%空気の気相下で1〜1.5時間培養した受精能獲得精子を24℃、100%空気、あるいは24℃、5%CO2、95%空気の気相下で24時間培養(放置)した精子を37℃、5%CO2、95%空気の気相下で1〜1.5時間追加培養して媒精した結果、150精子/μlの濃度の精子では37.46%、750精子/μlの濃度の精子では63.66%の受精率が得られています。さらに、24℃、100%空気の条件で24時間培養(放置)する際の精子濃度を2.4×10^4/μlに高めることによって100%近い受精率が得られることも報告されています。得られた受精卵は体外培養によって高率に胚盤胞に発生すること、移植によって移植胚の70%以上が産仔に発生することも示されています。ちなみに、冷蔵庫温度で保存された受精能獲得精子の受精率は、37℃と同様に極めて低いものでした(Jishage & Suzuki, Maintenance of the fertilizing ability in capacitated mouse spermatozoa. J Reprod Dev 39; 363-367, 1993)。したがいまして、今日使用した精子のシャーレを机の上に置いておけば、明日、温め直して再利用できるということになります。
Q13:体外受精後の受精卵を受精用培地から体外培養用培地(mWMやKSOM、mCZB)に移すベストなタイミングはいつでしょうか?2細胞期で移すより、前核期で移したほうが良いでしょうか?11/21/2016 培養液に添加される10〜100μMの濃度のEDTAは、そもそも2-cell blockを克服するために添加されていますが、2-cell blockに対するEDTAの添加は2細胞期では効果がなく、前核期から添加することが必要です。したがいまして、例え、2-cell blockを示さない系統の培養であっても前核期から添加することが望ましいと考えられます。
ICR系のマウスの場合、hCG注射後24時間に採卵し媒精しても受精はしますが正常に発生する卵はほとんど有りません。TYH培地で授精した場合の受精率は90%以上ですが、これらの受精卵子をWhitten培地+100μM EDTAで培養すると胚盤胞への発生率は30%程度です。
通常の体外受精(hCG投与後15.16時間に媒精)の受精率とその後の発生率について遜色の無い成績を得るためには、hCG注射後18時間以内に採卵して媒精することが必要です。 ICRの場合、hCG注射後15〜16時間で採卵して、その後8時間程度培地内に置いても受精は起こりますが、採卵後4時間を過ぎた当たりから異常受精が起こります。TYH培地で授精した場合の受精率は90%以上ですが、その後、Whitten培地+100μM EDTAで培養した場合の胚盤胞への発生率は40%程度です。
受精後の正常な発生を望むのであれば2時間以内に媒精した方が良いと思います。 Q16:ヒトやマウスにおいて、運動性の低い精子を用いた体外受精をする場合に透明帯の一部を切開してバイパスすることが推奨されていますが、これに使用する機材(レーザー照射装置)が非常に高価です。これを用いることなく透明帯をバイパス方法はないのでしょうか?
マウスにおいて、マニュアルで透明帯を切開する方法が報告されています。これは、未受精卵子をシュクロース溶液に暴露することによって卵細胞質を収縮させ、囲卵腔の拡大を図った後に注射針を用いて透明帯を切開する方法で、凍結融解マウス精子の受精率向上に大きく寄与することが示されています。しかし、この方法では、どうしても透明帯の切開が大きくなることから、受精卵子を卵管に移植すると割球が透明帯の切開部分から脱出してしまい、満足な移植成績を得ることができないので、桑実胚以降まで体外培養して子宮に移植することが必要です(Nakagata et al., Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod 57: 1050-1055, 1997)。 この弊害を解決する手段としては、ピエゾマイクロマニプレーターを用いて透明帯を切開することが有効であることも報告されています。この方法では、透明帯を任意の長さに切開することが可能ですので、受精卵子を卵管に移植することを可能とさせています(Kawase et al., Effect of partial incision of the zona pellucida by piezo-micromanipulator for in vitro fertilization using frozen-thawed mouse spermatozoa on the developmental rate of embryos transferred at 2-cell stage. Biol Reprod 66: 381-385, 2002)。一度、試してみてください。 Q17:マウスの過排卵処理においては幼若マウスの方がホルモンへの反応性が高く多くの卵子を得ることができると聞いたので、ICRの3週令程度の幼若マウスに過排卵処理を施しましたが、得られた卵子数は12週令のマウスより少ないものでした。なぜでしょうか?過排卵処理はPMSGとhCGが各5単位で、48時間間隔で皮下に投与しました。採卵はhCG投与後15時間で行いました。
幼若マウスを用いた過排卵処理では、系統によって反応性が大きく異なり、C57BL等においては非常に多くの卵子を得ることができますが、ICR等では成熟マウスより少ない卵子しか得ることが出来ないようです。また、多く排卵される系統においても3週令前後で過排卵処理を施した場合、その後の発生が芳しくない場合もあります。そのような系統においても、4週令まで待って過排卵を施すことで排卵数も多くその後の発生にも問題の無い卵子が採卵できるようです。 C57BLの場合3週令で過排卵処理を施すと排卵陽性個体は80%以上、排卵数は平均35〜40個ですが、2細胞期で発生が停止してしまう場合があります。4週令では排卵陽性個体は80%以上、排卵数は平均25〜30個と若干排卵数は減少するのですが発生停止卵は見られません。 Q18:マウスの過排卵処置において、hCGは暗期で作用して排卵を促すとされているので、通常、夕方に投与していますが、朝にPMSGとhCGの投与を行っても過剰排卵を誘起することが出来るので11/16/2016 Q18:マウスの過排卵処置において、hCGは暗期で作用して排卵を促すとされているので、通常、夕方に投与していますが、朝にPMSGとhCGの投与を行っても過剰排卵を誘起することが出来るのでしょうか?
朝8時に48時間間隔で過排卵処理を行なうと、hCG投与後13時間以降に通常の過剰排卵処理と同程度の排卵数を得ることができます。 また、マウス胚の操作マニュアル(第3版)、第3章トランスジェニックマウスおよびキメラマウスの項に下記の記述がありますので、参考にしてください。「ほとんどの系統では、PMSG注射とhCG注射の間に42〜48時間の間隔をおくことが、卵の収率について最適であることが知られている。一般に、排卵はhCG注射後10〜13時間後に起こるが、正確に排卵時間を制御するためには内因性LHの放出前にhCGを投与することが重要である。ほとんどの系統ではPMSG注射後2回目の暗期の中間点から15〜20時間後に内因性LHの放出が起こる。例えば、明期を午前5時〜午後7時とした場合、PMSGは午後1時から午後2時に、hCGはその46〜48時間後、通常、午後0時から午後1時に投与すれば、少なくとも内因性LH放出の2〜3時間前となる。」 オスに関しては30か月齢でも運動性のある精子が得られれば可能です。しかし、メスは12か月齢を過ぎるとホルモンに対する感受性が低下し未受精卵の採取が難しくなります。この時経験したのは、オスはB6バックのトランスジェニックマウスで、2年半もの間、マウス室の傍らで忘れられていたところを保存胚の作製が依頼されたものでした。メスに関しては週齢差を検討したわけではありませんが、系統維持などで、3産程度させた後に保存胚作製の依頼が来るケースもあり、そのような場合では12か月齢以上となっており、過排卵処置がうまくいかないケースがありました。
IVCS系統を用いて雌雄の加齢に伴う妊孕能の低下、過剰排卵処理によるレスポンスおよび体外受精成績を検討した報告があります。この報告によるとIVCS系統では、初交配を6ヶ月令を過ぎて迎えると胚の吸収率が大きく増加することから、自然交配で5ケ月齢までに産子が得られない場合には、体外受精を適用するのが望ましいと思われます。 また、外因性のホルモンに対する反応も加齢とともに低下しており、PMSGおよびhCG各5単位の過剰排卵処理では2ヶ月令の反応が最も高く平均64個の卵子が得られますが、7ケ月令、9ヶ月令および11ヶ月令では、それぞれ、15、10、および3であったと報告されています。体外受精成績をみると、低率ながら11ヶ月令の雌雄マウス由来の産子が得られていますが(受精率:51%、移植後の発生率:21%)、少なくとも、この系統の場合には11ヶ月令までに体外受精を適用することが望ましいと考えられます。(Suzuki et al., Relationship between age-related decline in fertility and in vitro fertilization rate in IVCS mice. J Reprod Dev 40: 107-116, 1994.) 染色時に用いる固定液の種類により異なります。少量のエタノールであれば問題ありませんが、酢酸を用いる場合、酢酸は卵子や受精卵の生存性に悪影響を及ぼしますので別の部屋で操作することが必要です。さらに、ドラフト等の排気装置があることが望ましいと思われます
紫外線は受精卵の生存性に良くありませんので、可能であれば、紫外線放射量の少ない紫外線吸収膜付美術館、博物館用蛍光灯を用いることが望ましいです。商品例:パナソニック、FL40S・W-EDL・NU
PMSGに反応しての内因性LHの放出時間は明暗周期に依存するので、入手後は数日間、飼育室の明暗周期に適応させる必要があります。
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